北京协和医学院赵林课题组及中国医学科学院基础医学研究所韩钦、赵春华及王晓月课题组合作发表了文章“Single-cell
RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast
subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric
cancer“。文章发现炎症肿瘤相关成纤维细胞(iCAFs)和胞外基质肿瘤相关成纤维细胞(eCAFs)不仅表现出增强的促侵袭活性，而且还能动员周围的免疫
细胞构建有利于肿瘤的微环境。该研究挖掘了肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)在胃癌进展中的关键作用，为胃癌治疗提供了潜在靶点。
研 究 背 景
胃癌(GC)是最常见的癌症之一，也是全球癌症相关死亡的第四大原因。晚期胃癌患者预后较差，平均生存期中期不到1年，因此，迫切需要开发新的药物来提高胃癌患者的总生存率。有研究表明，CAFs具有促癌作用，它们是癌症治疗的潜在治疗靶点。可胃癌组织中的CAFs异质性机制尚不清楚，减缓了靶向CAFs的临床转化。因此，全面了解GC中CAF亚群的分类、功能、激活阶段和空间分布,对治疗胃癌具有重要意义。
研 究 方 法
本研究通过对8例胃癌患者的肿瘤组织和邻近粘膜(AM)样本进行单细胞转录组测序，分析了CAF亚群的特征和受CAF亚群调控的肿瘤微环境(TME)成分之间的动态通信。并通过免疫组化染色，进一步验证不同胃癌病理亚型中CAF亚群的空间分布，以及这些CAF亚群与原肿瘤免疫细胞亚群之间的互作关系。
主 要 结 果
单细胞测序揭示了TME中7种主要细胞类型
通过对胃癌患者的肿瘤组织和AM样本进行单细胞转录组测序，共获得36,897个细胞，其中肿瘤组织17,376个细胞，AM组织19,521个细胞（图1A）。鉴定出23个细胞亚群，这些亚群被注释为7种细胞类型：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和肥大细胞(图1B-C）。其中，上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T细胞和B细胞的细胞类型中含有多个细胞亚群，这表明这些细胞类型可能是异质性的(图1B）。进一步研究发现，不同患者间细胞类型组成比例不同，且肿瘤组织和AM组织间细胞类型组成比例也有所不同(图1D）。此外，根据每个细胞中细胞周期相关基因的表达水平，分析每个细胞所处的细胞周期状态，结果发现来自GC样本的大多数T细胞和一小部分上皮细胞处于细胞周期的G2、M或S期，而其他细胞处于细胞周期的G1期（图1E）。
图1 胃癌组织和癌旁组织单细胞转录组分析
来源肿瘤的上皮细胞在患者中存在异质性
上皮细胞是肿瘤组织和癌旁组织中最丰富的细胞类型。研究者对11,187个上皮细胞进行进一步分析，鉴定16个上皮细胞亚群，其中8个亚群主要来源于肿瘤样本（图2B），根据基因表达情况，鉴定了9种上皮细胞亚
型（图2A）。除“癌症干细胞1”和癌症干细胞2”外，这些细胞亚型在肿瘤组织和癌旁组织中均被识别出来。这两个亚群主要来源于患者1和患者3的肿瘤样本，说明患者间的肿瘤上皮细胞具有高度的异质性（图2C)。此外，来自肿瘤样本的部分上皮细胞显示出部分上皮-间充质转化(p-EMT)特征基因的表达水平增加（图2D-E）肿瘤来源的第10亚群显示出p-EM相关基因的高水平表达（图2F），表明该亚群代表了一个经历p-EMT活性的细胞亚群。因此，我们将第10亚群命名为EMT细胞亚群。
图2 GC组织中上皮细胞基因表达的异质性
部分GC相关的内皮细胞表现出内皮-间质转化(EndMT)的特征
内皮细胞受到TME的严格调控，TME对肿瘤生长和转移至关重要。研究者进一步将2973个内皮细胞聚类为13个内皮细胞亚群（图3A），其中亚群8被鉴定为淋巴内皮细胞系，其余的内皮细胞亚群被鉴定为血液内皮细胞（图3A-B）。通过对差异基因分析发现，相对AM样本，肿瘤来源的血液内皮细胞中与细胞黏附调节和细胞外基质组织相关的基因的表达上调（图3C），而且，在亚群4中内皮细胞Marker基因(VWF)和成纤维细胞Marker基因(COL1A1、COL1A2、ACTA2))高表达（图3D-F）。通过对来自不同队列的胃癌患者的样本进行免疫荧光染色，结果鉴定出一组在肿瘤样本中共同表达VWF和α-SMA的细胞（图3G）。研究者对内皮细胞和成纤维细胞进行拟时间分析，发现内皮细胞亚群4中位于内皮细胞和成纤维细胞发育轨迹的的中间阶段（图3H-I）。内皮-间充质转化(EndMT)是胚胎发育过程中血管生成的关键步骤，一些研究表明，EndMT也在肿瘤进展中发挥作用，研究者经过分析将内皮-间质转化(EndMT)的4亚群命名为EndMT亚型。
图3 .GC组织和AM样本中的内皮细胞亚群分析
eCAFs促进侵袭，并与TCGA总体生存期缩短相关
肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)基于特定Marker基因的表达，确定了四个主要的亚群：肌成纤维细胞、周细胞、细胞外基质CAFs(eCAFs)和免疫调节CAFs(iCAFs)（图4A-B），通过对这四个成纤维细胞亚群中的差异表达基因(DEGs)进行分析，结果发现在肌成纤维细胞中高表达与肌肉收缩、血管平滑肌细胞增殖和血管发育相关的基因，证实了它们作为肌成纤维细胞在内皮分化过程中发挥了调节作用；周细胞中与血管发育相关基因上调表达，表明周细胞可以包裹毛细血管并促进它们的存活；iCAFs高水平表达CXCL12、IL6和CXCL14等炎性相关的Marker基因，在肿瘤来源的iCAFs中上调的IL6ST、NFKBIA、NT5E、SERPINF1和NFKBIZ基因与炎症反应的调控相关，表明它们在与免疫细胞的沟通中发挥了作用；此外，研究者发现了一个之前未报道的CAF亚群，该CAF亚群高表达参与ECM重构的基因，包括编码胶原和胶原代谢酶的基因（图4C）；因此，将它们定义为细胞外基质CAFs(eCAFs)。肿瘤来源的eCAFs高表达与肿瘤侵袭相关的基因(MMP14、LOXL2和POSTN)（图4D），这表明eCAFs是肿瘤转移的TME的重要组成部分。通过对423份TCGA
胃癌样本的整体转录组中基因表达谱与预后之间的相关性分析，发现POSTN基因表达水平高的患者，总生存期较短（图4E）。这些结果表明，eCAFs代表了一个重要的CAF亚群，可促进肿瘤转移，进而影响胃癌患者的预后。
图4 .GC组织和AM样本中的成纤维细胞亚群分析
GC的TME表现为免疫抑制状态
T细胞是TME中含量最丰富的免疫细胞。通过分析GC组织和AM组织中的6,874个T细胞，确定了14个T细胞亚群（图5A）。基于基因表达特征，鉴定了12个主要亚群，包括8个CD8+T细胞亚群和4个CD4+T细胞亚群（图5A-B）。通过Marker基因的表达，进一步将这些T细胞亚群进行注释为8种T细胞亚型（图5A）。而且，还鉴定了两个衰竭的T细胞亚群，CD8-C3-PDCD1和CD4-C4-CXCL13。CD8-C3-PDCD1亚群的PDCD1和HAVCR2基因显著上调，而CD4-C4-CXCL13亚群的PDCD1、TIGIT和CTLA4基因显著上调(图5B)。值得注意的是，CD8-C3-PDCD1亚群高水平表达CD69和各种细胞毒性基因，如GZMH、GZML和NKG7，表明它可能被激活(图5B)。研究者通过在连续病理切片中对CD8和PD1进行免疫组化和图像配准分析，证实了在GC组织中存在耗尽性T细胞。T细胞在GC的淋巴结构中同时表达CD8和PD1(图5C-D）。这些结果表明，GC处于免疫抑制状态。
图5 .GC组织和AM样本中的T细胞亚群分析
不同肿瘤微环境间的细胞通信分析
使用CellPhoneDB工具包对单细胞数据进行了细胞间通信分析。将免疫细胞募集到肿瘤微环境是一个可以在癌症治疗过程中被靶向的过程。研究者分析了肿瘤微环境中不同基质细胞和免疫细胞亚群之间的细胞-细胞通信（图6A-B）。分析显示，iCAFs通过与趋化因子、炎症细胞因子反应和免疫调节相关的受体-配体相互作用，与CD4+T细胞、CD8+T细胞、treg和巨噬细胞进行通信（图6C）。综上所述，iCAFs在淋巴细胞的募集中发挥了作用。研究者通过免疫组化发现，位于淋巴样结节样结构中的CAF）的主要亚群是iCAFs（图6D），它们位于CD8阳性和PD1阳性的T细胞周围，这表明iCAFs参与了T细胞的调节。
图6 肿瘤微环境间的细胞通信
研 究 结 论
本文使用单细胞RNA测序，从8名胃癌患者的肿瘤和邻近黏膜组织中分析了大约37,000个细胞。主要讨论了胃癌组织
TME中的CAFs，包括分类、功能、起源、与其他细胞亚群的相互作用，以及不同病理类型的空间分布。这些结果揭示了CAFs在调节TME中的独特作用，包括免疫调节、侵袭、迁移和血管生成等过程。重要的是，胃癌中eCAF趋化能力增强，促进了M2巨噬细胞的募集，并与胃癌患者的不良预后相关，这表明抑制eCAF激活可能是胃癌患者的潜在治疗靶点。
参考文献：
Li
X, Sun Z, Peng G, Xiao Y, Guo J, Wu B, Li X, Zhou W, Li J, Li Z, Bai C,
Zhao L, Han Q, Zhao RC, Wang X. Single-cell RNA sequencing reveals a
pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor
clinical outcomes in patients with gastric cancer. Theranostics. 2022 Jan 1;12(2):620-638. doi: 10.7150/thno.60540. PMID: 34976204; PMCID: PMC8692898.
王贝 | 文案
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