免疫治疗已在多种肿瘤的治疗中显示出有效性和安全性，成为恶性肿瘤治疗中新的里程碑。但是，不是所有患者都能从免疫治疗中获益，因此需要借助特定的生物标志物对患者分层、提供个性化治疗方案和预测免疫治疗的疗效。
上一期详细介绍了免疫检查点抑制剂疗效生物标志物PD-L1，解答为什么PD-L1能成为医学诊断和抗肿瘤治疗的关键靶点。既然知道它在免疫治疗中发挥着关键作用，那么如何获得更准确的PD-LI免疫组化结果，筛选出更适合抗PD-1/PD-L1免疫疗法的病人，缓解病况甚至痊愈成为了至关重要的课题。
针对这一问题，为大家分享高分文献中如何解决这一关键难题的方法，后续小编也将会继续整理更新，敬请期待！
免疫检查点—PD-L1背景
PD-L1(programmed death ligand 1，程序性死亡受体配体1)，是PD-1（programmed cell death 1,程序性死亡受体1）的配体。
PD-L1属于细胞膜上的一个跨膜蛋白，由CD274基因编码，诱导表达于T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓来源的肥大细胞和非造血细胞的表面上，在干扰素及其他炎症因子刺激应答的肿瘤组织和其他组织中都可能会迅速上调。
研究表明当肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞等免疫细胞上的PD-1结合后，肿瘤细胞发出抑制性信号，进而T细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制。
图1. PD-L1 表达调控机制
图片来源：Immunity. 2018 Mar ; 48: 434-452
美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心（MD Anderson Cancer Center）的洪明奇教授团队在国际顶级期刊杂志Cancer Cell上发表文章“Removal of N-Linked Glycosylation Enhances PD-L1 Detection and Predicts Anti-PD-1/PD-L1 Therapeutic Efficacy”，利用糖苷内切酶PNGase F去除细胞表面N-连接糖基化增强PD-1/PD-L1检测效力，为临床PD-1/PD-L1阻断生物疗法的有效实施提供理论支持。
绝大多数的膜蛋白，存在蛋白翻译后修饰，特别是糖基化，可通过影响蛋白质的结构及其与其他分子的相互作用来调节许多重要的细胞功能，包括蛋白质生物合成，定位和其他作用。
PD-L1是一个高度糖基化的蛋白质，PD-L1的N-连接糖基化大约占PD-L1蛋白分子量的52％。PD-L1蛋白外部可能被特定的糖基结构所覆盖，使其多肽抗原不能被PD-L1抗体准确辨识并结合，造成PD-L1免疫组织化学结果假阴性误判，呈现出与治疗结果相互矛盾的现象。
研究者通过糖苷内切酶（PNGase F）的消化，从细胞表面抗原中去除PD-L1聚糖部分，这一过程称为去糖基化。去糖基化能显着提高PD-L1抗体的结合亲和力和信号强度，从而实现更准确的PD-L1定量和临床结果预测。
图2. PD-L1的去糖基化增强抗原-抗体结合示意图
研究成果：
1、去糖基化增强人癌细胞中的抗PD-L1信号
通过显微共聚焦、ELISA和免疫组化等方法比较，检测肿瘤细胞用PNGase F处理前后细胞表面PD-L1表达量，研究发现PNGase F处理后PD-L1检测量显著提高。
通过饱和结合试验发现，在A549和H1299细胞中去糖基化的PD-L1抗原-抗体结合的亲和力增加了约25倍和55倍。
结果表明PD-L1的糖基化阻碍了其被抗PD-L1抗体检测，而PD-L1去糖基化后消除抗体识别的空间位阻，从而提高抗体的检测灵敏度。
图3.去糖基化增强癌细胞中的抗PD-L1信号
2、去糖基化显着增强人肿瘤组织样本中PD-L1的检测信号用PNGase F处理多种肿瘤组织的样本（n=200，乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌各40个样本）以及单独分析的肺癌（n = 149）和直肠癌（n = 92）组织样本，之后用IHC检测PD-L1表达量，并评估H得分。
结果显示PD-L1阳性IHC染色的患者数（37.5％-57.5％），在去糖基化后H得分(H-SCORE 即histochemistry score (组织化学评分），以下简称H得分）显着增加2倍以上，表明PD-L1的N-糖基化对其识别产生严重影响。
图4. 去糖基化显著增强人肿瘤组织样本中PD-L1的检测
3、去糖基化后PD-L1 检测的改善与PD-1/PD-L1 治疗的反应相关
IHC检测FFPE组织（n=95），比较分析PNGase F处理前后PD-L1的表达量和临床数据的关系，研究发现用PNGase F进行处理后，PD-L1的H得分与患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）显著相关。
此外，其中有49例患者的总生存期（overall survival，OS）与PD-L1水平显著相关。证明样本去糖基化使PD-L1表达评估更准确，更好地预测对抗PD-1/PD-L1疗法的临床反应。
图5. 不同肿瘤组织PNGase F处理前后H得分数值及PFS/OS生存曲线
4、去糖基化后PD-L1信号增加有利于治疗选择
通过对比研究95例肺癌患者组织样本，其中约7％-11％的患者，PD-L1 TPS指标<1％，通过样本去糖基化IHC染色后，PD-L1 TPS指标增加至>49％，表明这些患者适合进行抗PD-1/PD-L1阻断治疗。即去糖基化后增加肿瘤患者的治疗方法的可选择性。
图6. 去糖基化后增加的PD-L1信号有利于治疗选择
5、去糖基化提高了PD-L1免疫治疗的预测能力
通过对比使用和未使用PNGase F治疗的两组病例（n=95) 评估PD-L1的H值，中值作为截断值 （H值= 57. 5）。经过PNGase F预处理后，具有高水平PD-L1的患者对免疫治疗的反应显著改善，风险评估值（HR）明显降低，从0.82下降到0.58。N-连接糖基化的去除提高了PD-L1指导免疫治疗的预测能力。
图7. 去糖基化增强PD-L1免疫治疗的预测能力
综上所述，PD-L1的N-连接糖基化阻碍PD-L1抗体的识别，PD-L1的酶促反应去糖基化后显著增强PD-L1抗体的结合亲和力和信号强度，实现了更准确的PD-L1定量。
患者组织切片的糖基化可以防止PD-L1的假阴性检测，提高了临床结果预测能力，潜在地影响患者分层，提供更加个性化的治疗方案。该项研究证实，去糖基化的PD-L1在指导免疫治疗时更可靠，对于该疗法的临床应用具有重要意义。
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Human lung adenocarcinoma
Human intestinal adenocarcinoma
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[KO Validated] PD-L1/CD274 Rabbit mAb (A19135)
应用：WB,IHC 种属：Human,Mouse,Rat
Human placenta
PD-L1/CD274 Rabbit pAb (A1645)
应用：WB,IHC,IF 种属：Human,Mouse,Rat
Human gastric cancer tissue(客户反馈数据）
Human liver cancer(客户反馈数据）
PD-1/CD279 Mouse mAb (A20217)
应用：IHC 种属：Human
Human tonsil
Human liver（negative control）
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